Det in situ hybridisering er en metode til at detektere kromosomale afvigelser. Visse kromosomer er markeret med fluorescerende farvestoffer og bundet til en DNA-sonde. Denne teknik anvendes til prenatal diagnose af genmutationer.
Hvad er hybridisering in situ?
I tilfælde af hybridisering in situ eller Fluorescens in situ hybridisering nukleinsyrer fra RNA eller DNA påvises i visse væv eller en celle ved anvendelse af molekylærgenetiske metoder. Normalt bruges denne type diagnose til at påvise en strukturel eller numerisk kromosomal abnormalitet under graviditet.
Til dette formål anvendes en kunstigt fremstillet sonde, der i sig selv består af nukleinsyre. Derefter binder det sig til nukleinsyrerne i organismen gennem baseparring. Denne binding menes med udtrykket hybridisering. Beviset er baseret på patientens levende struktur og svarer derfor til in-situ-bevis. Dette skal adskilles fra in-vitro-metoder, hvor detekteringen finder sted i reagensglaset. Metoden blev udviklet i det 20. århundrede af forskere Joe Gall og Mary Lou Pardue.
Teknologi har udviklet sig siden da. Mens radioaktive prober blev anvendt på det tidspunkt, anvendes fx fluorescensmærkede sonder med en kovalent binding til markørmolekylerne i dag.
Funktion, effekt & mål
Hybridisering in situ anvendes sædvanligvis til at detektere kromosomale afvigelser, dvs. kromosomale anomalier, der ikke kan påvises i et karyogram. Dette betyder, at metoden altid bruges, når arvelige sygdomme skal bestemmes under graviditet.
Da kromosomafvigelser er et problem, som ikke bør undervurderes i dag, er brugen af metoden steget over tid. Hybridisering finder sted på basis af indfødte celler fra morens fostervand. Grundlaget for teknologien er bindingen af den farvemærkede sonde til DNA-dele. Takket være bindingen kan antallet af kopier senere evalueres med et mikroskop, da de individuelle kopier udsender et lyssignal og således kan synliggøres under mikroskopet. Der er forskellige procedurer. Enten finder analysen sted umiddelbart efter binding.
I dette tilfælde anvendes et fluorescerende farvestof såsom biotin, der er bundet direkte til DNA-sonden. Ved den indirekte metode til hybridisering in situ kan evalueringen ikke finde sted umiddelbart efter hybridisering, da fluorescerende stoffer kun kan binde til sonden efter hybridisering. Denne indirekte metode bruges oftere end den direkte, fordi den antages at være mere følsom. Foruden de kromosomspecifikke centrometer-DNA-prober er der også locusspecifikke DNA-prober, kromosomspecifikke DNA-biblioteksprober og sammenlignende genomhybridiseringer.
Kromosomspecifik centrometer-DNA-prober kan anvendes til at detektere kromosomalt numeriske afvigelser. Dette betyder, at de hovedsageligt bruges, når der er mistanke om duplikerede eller slettede kromosomer. De lokaliseringsspecifikke DNA-prober er især egnede til påvisning af minimale mutationer, der ikke kan påvises i karyogrammet. En kromosomspecifik DNA-biblioteksonde anvendes især til at detektere insertioner og translokationer.
Sammenlignende genomhybridisering er på den anden side en omfattende analyse af tab og gevinster i kromosomalt materiale. I dag er hybridisering in situ meget vigtig i diagnosen af forskellige kromosommutationer.Ved diagnosticering af Downs syndrom binder prober f.eks. Til kromosom 21. Til dette formål bruges normalt kromosomspecifikke sonder, som kan bruges, hvis der er mistanke om denne sygdom.
En mistanke kan f.eks. Opstå, hvis forældrene tidligere har født et barn med sygdommen, og ultralydbilledet er unormalt. Hvis der er en tredobbelt i stedet for en dobbeltbinding og derved udsendes et tredobbelt farvesignal, betragtes diagnosen som bekræftet.
Risici, bivirkninger og farer
I modsætning til for eksempel PCR er hybridisering in situ signifikant mindre modtagelig for kontaminering. Derudover er den tid, der kræves til processen, meget mindre. Eftersom embryoner især danner kromosommønstre, kan et mønster imidlertid ikke bruges til at bestemme resten af kromosomfordelingen og dermed den genetiske status for andre celler.
Farvesignaler kan også overlappe hinanden eller forblive usynlige af andre grunde. Som et resultat er hybridisering in situ som et diagnostisk værktøj relativt tilbøjelig til fejl under graviditeten. Der kan opstå forkert diagnoser, og forældre kan beslutte mod et sundt embryo. For at reducere modtageligheden for fejl ved hybridisering in situ bør mindst to embryonale celler undersøges samtidigt. Ved at undersøge to celler parallelt er der nu kun en ubetydelig risiko for fejldiagnose.
I et sådant tilfælde kan forældre absolut stole på diagnosen. Hybridisering in situ tilbydes ikke enhver gravid kvinde, men kun til kvinder fra en risikogruppe. Ikke desto mindre nægtes gravide kvinder ikke denne type diagnose på deres egen anmodning. Unormale ultralydfund eller et unormalt serum kan få en læge til at tilbyde den diagnostiske procedure. Selvom en stor del, men på ingen måde alle, af kromosomafvigelser kan diagnosticeres ved anvendelse af in-situ hybridisering.
Derfor må in-situ-hybridiseringen aldrig udføres alene, men skal altid anvendes i forbindelse med en konventionel kromosomtest. Pleje af den gravide kvinde spiller en vigtig rolle i denne procedure. Før analysen er der en dybdegående diskussion med den vordende mor om den diagnostiske metode, der forklarer risikoen, mulighederne og grænserne for teknologien.
.jpg)
.jpg)
